1.   引言

自从1990年Enzon开发的第一个蛋白质聚乙二醇化药物Adagen被FDA批准上市至今30多年来，已经有27个聚乙二醇化的药物被批上市销售。另外有近50个PEG化的药在各个不同的临床阶段。总体来说，聚乙二醇化药物的安全性已经得到临床的检验，30多年来没有任何一例关于聚乙二醇本身引起的临床毒性案例。

2.   PEG的安全性 

聚乙二醇（PEG）作为医药赋形剂历史悠久。分子量很小的PEG，在较高剂量下具有一定的肾毒性。当分子量大于1000时，一般没有毒性。例如，将分子量为1450、3350、6000的PEG静脉注射于兔子（最大总剂量为10g/kg）时，没有发现对动物有毒性。上个世纪60年代，美国Union Carbide公司也曾经对系列的小分子PEG（分子量200-9000Da）进行了系统的研究，发现这些小分子PEG总的来说是非常安全的，小鼠、大鼠、猪、猴子、兔子等的LD50 (g/kg 体重)都在10-50之间。新陈代谢测试表明，肾脏是从体内去除低分子量PEG的主要途径。随着分子量的增加，PEG也会从粪便排泄清除。有研究表明，mPEG（分子量40,000）修饰的干扰素通过肝脏代谢在粪便中排泄。

由于mPEG和PEG化学结构非常相似，仅在一个PEG末端用一个甲氧基取代了一个羟基，因此从早期PEG动物测试数据可以推断出mPEG也是生物安全的。但是，近年来，也有研究发现，mPEG修饰的蛋白质药物引起人体产生针对PEG的抗体，从而加速药物的清除。这些抗体的产生可能与其末端的单甲氧基有关。但是，到目前为止，抗PEG抗体的发现仅限于PEG修饰的蛋白质药物本身。这些抗PEG抗体在一定程度上影响了药物的剂量，但还没有发现抗PEG抗体对人体产生其他负面影响。

国际组织BIOSafe（生物技术工业组织行业组织委员会，BIO）于2013年¹进行过一次制药行业针对PEGylation药物的调查。调查涉及到的临床适应症包括类风湿性关节炎，2型糖尿病，与年龄有关的黄斑变性，肌肉消瘦和多发性硬化症等，这些疾病都是需要进行长期治疗的慢性病。有十家公司提供了包括在研药在内的17种PEG化生物制药的毒理学数据。该调查的目的是总结聚乙二醇化生物制药毒理学数据，为监管部门提供评估聚乙二醇化生物制药的基本毒理学框架。调查的17种聚乙二醇化药物的分子量从25 kDa到350 kDa不等，PEG部分的分子量范围为分支或线性PEG 20 kDa至60 kDa。调查发现17种化合物中有10种有着与PEG相关的组织空泡化现象；单个20kPEG链接的4种产品均未发现细胞空泡，而30至40 kDa的PEG产品在为期4周的研究中却观察到了细胞空泡，但没有发现其他与PEG相关的毒性报道。然而这些动物实验观察到的PEG引起空泡化的现象，很难在人体内观察到。另外，在非临床研究中，6种产品检测了抗PEG抗体，但均未观察到阳性反应。另有一家公司指出，在小鼠模型和猕猴中观察到了IgM和IgG抗PEG抗体的形成，但结果并未被认为对人的安全性有任何影响。2015年11月4-5日，BIOSafe第五届欧洲成员会在德国的Ludwigshanfen召开，聚乙二醇化生物药的安全性再次成为了会议的一个议题，这包括PEG化药物在动物体内引起的细胞空泡，anti-PEG的抗体，以及FDA对PEG化药物的态度等。然而，调查结果也没有做出PEG是不安全的结论。

3.   PEG组织分布和代谢

PEG的分子量会影响组织分布和空泡化。高剂量（100mg/kg）的游离PEG（未耦合的10kDa,20kDa以及40kDa的PEG）（每天一次，或者隔天一次，或者每周两次，或者每周一次，或者每周两次）持续使用3个月²，通过免疫染色可以发现，10kDa的PEG 主要分布在大鼠的肾小管上皮和肺泡巨噬细胞以及肝Kupffer细胞中，但没有细胞空泡化。而40kDa PEG则主要分布与大鼠的脾囊下红髓巨噬细胞、肾间质巨噬细胞和肾小球足细胞/内皮细胞、脉络丛上皮细胞和间质巨噬细胞和大脑皮质毛细血管等，并观察到细胞空泡，20kDa的PEG分布界于10kDa和40kDa的 PEG 之间。尚不清楚这些从游离的PEG得到的实验数据可以准确地外推到PEG化药物。药物组织分布方式可能更取决于PEG剂量、药物受体介导的摄取和/或配体特异性转运等因素。日本科学家对小鼠静脉注射（iv）分子量不同的¹²⁵I标记的PEG，发现组织积累的时间依赖于血管渗透性，较大的PEG从循环中缓慢移位与组织。半衰期从3kDa PEG的18分钟增加到190kDa PEG的24小时³。使用¹⁴C标记评估小鼠中PEG-40 kDa蛋白的组织分布发现，相对于其他组织（在小鼠中评估的组织：血液，肿瘤，脑，骨髓，心脏，肝，肺，肾和肌肉），在大脑中发现的PEG最低。

PEG化药物的蛋白质部分都将被分解为氨基酸。由于PEG几乎不能被代谢，因此可将PEG与蛋白质活性药物部分分开^{4, 5}。游离PEG分子通过肾脏清除可能是最常见的PEG排泄途径。对于大的PEG分子，有证据表明，分子量大于肾小球滤过率截止值的长线性PEG分子仍然可以通过肾小球，并且可以被肾脏排泄。

PEG代谢仅限于羟基的代谢修饰，而现有数据表明，在人类中看到的代谢物与在动物中看到的是一致的。此外，对于PEG化的生物制品， 代谢对PEG在体内的消除并不起到主导作用。因此，PEG代谢物不会成为在药物研发中的一个重大问题，更何况研究聚乙二醇化生物制品的代谢并不是那么简单。

4.   细胞空泡（Cellular vacuolation）

PEG结构简单，化学惰性和低毒性^5，6。在已批准的PEG化生物药物的非临床研究中，发现的副作用通常只与活性药物（API）的预期药理作用有关，而与PEG部分本身无关。然而，在非临床毒理学研究中，超过一半（10/17=59%）的已批准PEG化药物被观察到与PEG相关的组织学变化，其特征为某些组织和细胞类型中的细胞空泡化(cellular vacuolation)。这些变化与诸如组织变性，坏死和细胞变形等病理学影响或研究终点（包括血液学，临床化学，尿液分析或器官重量）的变化并无任何关系。虽然目前还不清楚这些在动物实验观察到的现象是否会有临床上的意义，但是组织空泡的评估仍然是聚乙二醇化生物药物毒理学评估的重要组成部分。

对于与组织空泡化相关的那些聚乙二醇化的生物药物，从调查数据可以看出，空泡化的发生，发生率和严重性随着剂量，给药频率和持续时间的增加而增加。免疫组织化学研究结果表明，液泡基本代表PEG的存在，光学显微镜观察也表明PEG相关的液泡与溶酶体在形态上是一致的。但是这些观察结果尚未通过超微结构研究得到证实。

研究发现，在PEG分子量≥30-kDa的情况下，可以更频繁地观察到PEG相关的空泡作用。一个原因可能是5kDa或更小的PEG分子容易通过肾小球过滤排泄，因此全身暴露时间更短。在毒理学研究中，也偶尔发现较低分子量PEG的聚乙二醇化药物具有空泡现象，例如，使用Krystexxa时，因为该产品包含许多10kDa PEG分子（8至10个），导致产生较大的PEG剂量而出现空泡现象。

但是，不同PEG分子量（20-kDa PEG与50-kDa PEG）耦合的肿瘤坏死因子结合蛋白（TNF-bp）引起大鼠肾小管空泡化的严重程度与分子量和PEG复杂性也有关。50-kDa PEG蛋白二聚体（总分子量86-kDa）引起的空泡化不如20-KDa的PEG-TNF-bp严重（总分子量38-kDa）。然而在当单独用这些PEG分子进行该实验时，并未观察到肾小管空泡化。这些观察到的差异性可能与蛋白质部分引起的暴露/再摄取以及聚乙二醇化单体与二聚体的肾小球过滤差异有关。

尽管大多数与PEG相关的空泡现象都出现在分子量大于30-kDa，但前述的一些例外表明，简单地将空泡现象的产生和PEG分子量大小联系在一起不是100%可靠的。 PEG化药物分子总体大小，剂量，给药频率和药理特性因素，包括非特异性或药物靶标受体介导的摄取，PK和生理过滤障碍等因素都会影响空泡的产生。细胞空泡化形成的原因，可以是细胞响应多种影响和刺激而发生的非特异性生理现象，因此在PEG化生物药毒理研究中发现的空泡结果可能并不总是由于组织中存在PEG。

总之，对空泡形成的细节，它们与细胞器的结合，这些空泡的含量以及它们与PEG的关系，以及PEG相关效应对器官功能潜在的影响的理解，现在仍然是一个空白。

 5.    产生空泡的细胞类型

5.1 吞噬细胞

用PEG或PEG化的生物药物后，含有空泡的吞噬细胞包括肝中的库普弗细胞(Kupffer cells)，脾脏中的网状内皮细胞以及各种组织（肺，皮下注射皮下注射后的皮肤，淋巴结，骨髓，胸腺，脂肪组织，卵巢，睾丸，膀胱固有层，阴道，子宫颈，子宫内膜间质，大脑，肾上腺皮质，垂体和脉络丛）。由于从循环中去除异物是这些巨噬细胞和组织细胞的正常功能，因此所产生的空泡化被认为是吞噬细胞中的正常生理反应。目前尚不清楚吞噬细胞摄取PEG的机制，是通过游离PEG的吞噬，还是通过噬细胞吞噬包含PEG的受损/衰老细胞，或者是通过吞噬细胞特有的其他潜在机制。根据电子显微镜观察到的粒径，能量需求和形态属性，吞噬细胞的内吞摄取可被分类为胞饮作用或吞噬作用（大于250 nm的大颗粒）。这些吞噬体和内体与溶酶体融合，导致溶化的食料被回收或被降解。难消化的物质被胞吐或保留在溶酶体中形成残留体。

因为体内PEG代谢的酶很少，在吞噬体和溶酶体中PEG不能被代谢^{4, 5, 7}。吞噬细胞一旦摄取了PEG，细胞最后的命运如何目前尚不清楚。 PEG可能被胞外分泌，被肝脏，肾脏和脾脏等器官从体内清除，或者在其整个生命周期中仍保留在巨噬细胞中。不同类型的巨噬细胞具有不同的寿命。尽管单核细胞衍生的巨噬细胞在周围组织中寿命短，并且在2周内死亡，但是其他组织巨噬细胞的寿命更长，可以存活数月，例如，Kupffer细胞可存活5周至14个月。

5.2 非吞噬细胞

通过光学显微镜观察到有限的含有PEG相关的液泡的非吞噬细胞类型，包括肾内的近端肾小管上皮细胞，肾小球足细胞和肾小球内皮细胞，肾上腺皮质细胞，脉络丛上皮细胞，以及大脑皮层毛细血管和主动脉中的内皮细胞^{2, 8}。在其他组织的上皮细胞中也观察到了空泡，包括关节（滑膜），肝脏，胰岛，前列腺，附睾，膀胱，乳腺，甲状腺和睫状体，以及背根神经元神经节（DRG）和大脑。

5.3 神经系统中的空泡细胞

由于大多数神经元是不可再生的或缓慢的可再生细胞，因此PEG对神经细胞的安全性评估也特别受重视。在BIOSafe调查中，发现对食蟹猴用高剂量（100mg/kg/week）的Cimzia (PEG-TNFa Fab)连续26周以后，动物的脉络膜丛（Choroid plexus）有空泡形成。但是，毒理学的核心问题就是剂量问题。许多人质疑，这种远远高于临床剂量的动物实验研究结果，是否具有临床意义，值得商榷。而且，脉络丛细胞中与PEG相关空泡的存在并不表示PEG的存在或PEG转运到神经元或神经胶质组织中。

在3个月内静脉给予高剂量的未与药物结合的10-，20-和40-kDa PEG分子后，在脉络丛巨噬细胞和脉络丛丛上皮细胞中仅观察到40-kDa PEG的PEG免疫反应和空泡化，而在脑实质中未观察到空泡，提示脉络丛可能是作为血液与PEG的心室CSF之间的屏障，阻止了PEG进入大脑²。

尽管游离的PEG似乎未进入CNS，但当PEG耦合一些有助于跨过血脑屏障（BBB）的药物时，PEG可能会到达BBB内部。在大鼠中，尽管进入中枢神经系统的速度较慢。与40 kDa PEG结合的重组人IGF-1在脑组织和CSF中的稳态浓度要高于未PEG化的IGF-1。

6.  PEG相关空泡的可逆性

研究数据表明，如果有足够的恢复时间，空泡是可逆的。由于非临床毒理学研究中的恢复期通常太短，很难证明这种可逆性。一般而言，在无治疗期间，较大的空泡或多个空泡可能需要更长的时间才能消失。此外，空泡的保留时间可能反映了其所在的细胞群的缓慢更新，例如，组织巨噬细胞的寿命可长达14个月。其次，剂量增加和给药时间的延长与可逆性的降低相关。在一般情况下，尽管巨噬细胞或肾小管上皮细胞等细胞发生了明显的胞质空泡，未见到对器官功能的不利影响。使用PEG化药物后看到的细胞质空泡化是适应性的而非毒性反应，并且与清除PEG的需求增加有关。总之，空泡化不会对健康造成不利影响。

7.   抗PEG抗体（Anti-PEG antibodies）

PEG被认为是非抗原性，非免疫原性的分子，并已被用于降低蛋白质的免疫原性，保护蛋白质免受宿主免疫系统的清除。大多数聚乙二醇化的生物药物已被证明是安全有效的，并不产生抗PEG抗体（anti-PEG antibody）。但是，已有研究报告发现用PEG化药物治疗后会产生抗PEG抗体，并发现抗PEG抗体的产生与药物的功效降低、超敏反应等有关，但还没有发现抗PEG抗体对人体产生其他负面影响。目前尚不清楚为什么某些聚乙二醇化生物药物会诱导临床相关的抗PEG抗体反应，而另一些则不会。这是否与PEG部分的分子量，链接子类型，连接的PEG链数以及PEG化生物药物蛋白质部分的免疫原性等因素有关，还需要有进一步的探索和研究。

8.    监管机构（FDA和EMA）对PEG安全性的要求

尽管1990年美国食品药品监督管理局（FDA）批准了人类使用的首个PEG化蛋白（Enzon的Adagen），但直到2003年，欧洲药品管理局（EMA）才发行了关于聚乙二醇化药物产品分析表征的指南⁹，随后有两个有关聚乙醇化药物的表征分析的指南相继出台^{10, 11}。随着分析方法的改进，EMA也提高了对聚乙醇化药物表征分析的要求，2014年，EMA颁发了另外一份指南，代替2004年的指南¹²。

EMA的儿科委员会（PDCO）出于长效药应用于儿科人群所导致的长期毒性方面的担忧，特别是对儿童大脑发育产生的影响，EMA下属的人用药品委员会（CHMP）安全工作组专门发布了一份文件，概述了小儿患者使用PEG化药物的指南¹³。但是，鉴于积累PEG的上皮细胞约2-3年更新一次，2017年，PDCO又质疑脉络丛（choroid plexus）中的PEG积累是否真的存在稳态水平¹⁴。另外一个平行机构，负责评估人类药物风险管理各个方面的药物警戒风险评估委员会（PRAC）也在密切监视PEG化产品的安全性问题。

美国FDA尚未发布有关PEG或其他生物结合物的具体文件，仅仅要求聚乙二醇化的耦合物要符合ICH的常规生物产品指南，并满足CFR600系列要求。2014 FDA《治疗性蛋白质产品免疫原性评估行业指南》提出抗PEG抗体的问题，并要求在产品早期开发期间进行监测抗PEG抗体¹⁵。

9.   总结¹⁶

PEG 具有非常安全的毒理学特征，无论是长期和急性治疗，都具有很高的可耐受剂量。因为PEG对动物和人类的毒性与暴露关系已经非常清晰，新陈代谢/排泄也非常明白，PEG化的生物分子不会有额外的与PEG相关毒性担心。尽管如此，就像对任何正在开发的其他治疗性蛋白质一样，聚乙二醇化蛋白质在商业化之前必需完成相关物种的完整毒理学研究。总之，假设在适当的物种中生物分子的安评得到了令人满意的结果，PEG化生物分子中的PEG不会给PEG化产品带来额外的未量化的风险，原因是 1) 所涉及的PEG的量很低，2) PEG 的低毒性特征，3) 代谢物在所有种属中的相似性。

10.    参考文献

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3.            Yamaoka, T., Y. Tabata, and Y. Ikada, Distribution and tissue uptake of poly(ethylene glycol) with different molecular weights after intravenous administration to mice. J Pharm Sci, 1994. 83(4): p. 601-6.

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13.          EMA. CHMP safety working party’s response to the PDCO regarding the use of PEGylated drugproducts in the paediatric population. 2018  [cited 2020 04 October]; Available from: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2012/11/WC500135123.pdf.

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15.          FDA. Guidance for industry: immunogenicity assessment for therapeuticprotein products. 2014  [cited 2020 04 October]; Available from: https://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm338856.pdf.

16.          DRUG METABOLISM AND DISPOSITION （2007）Vol. 35, No. 1， p9-15.